染色质免疫沉淀(ChIP)被用于检测细胞核天然染色质结构内的蛋白质与DNA之间的相互作用。传统的ChIP实验首先需要将细胞固定,这使得蛋白质与DNA相互作用交联固定到位。然后利用酶或者超声的方法将染色质打断为片段,使用抗体对感兴趣的蛋白质以及与其结合的DNA进行免疫沉淀。最后解交联,对沉淀DNA进行纯化。纯化的DNA可进行进一步分析,如标准或定量PCR或测序。实验对染色质的完整性、抗原表位的稳定性以及免疫沉淀抗体的特异性较为敏感。这些变量在所研究的蛋白质与DNA相互作用具有较低的丰度和稳定性时变得更为关键。
ChIP实验可以主要包括以下几个步骤:
交联固定→染色质剪切→免疫沉淀→DNA纯化→DNA检测研究方向:
猪脂肪细胞chip实验
实验步骤:
1.准备充足的细胞或组织,一般情况下,细胞量不少于 10》6,组织样品量在 20~30 mg。ChIP 富集的 DNA 片段少常由起始样本量低及后续反应溶液对样本的过度稀释所造成。其次,在交联反应过程中,通常使用 1% 的甲醛固定细胞 10 分钟左右(过长的交联反应时间会使细胞形成大的交联聚合物,后续难以超声破碎)。
2.细胞用 1% 甲醛固定 10 分钟, 300 μl 样品用小美非接触超声仪 80% 的功率超声 20 秒间歇 40 秒,分别超声 20组、纯化后在 1% 的琼脂糖胶上电泳。ChIP 实验一般要求染色质片段在 200~100 bp 之间(如图)
3.超声处理优化过程
非接触超声过程中冰浴间歇的步骤很重要。因为超声脉冲会引起微环境的急剧升温,进而引起蛋白质的破坏/降解,影响后续的免疫沉淀反应
实验效果:
使用非接触聚能超声打断仪对脂肪细胞破碎前后效果图
实验解决的问题:
1、仪器多通道相对于手工单通道超声工作时更省力方便,实验更安全;
2、控温制冷对样品保护好,提取出的成分在数量和质量上比手工超声均质效果更好;
3、适用非接触聚能超声打断仪不会出现交叉感染,实验更省心
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